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                    RFLP和RAPD技術

                    發(fā)布時間: 2010-04-08  點擊次數(shù): 2601次

                    概 述
                      
                      DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種(個體)基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變,或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失,導致酶切片段大小發(fā)生了變化,這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測,從而可比較不同品種(個體)的DNA水平的差異(即多態(tài)性),多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆,位于染色體的不同位點,從而可以作為一種分子標記(Mark),構建分子圖譜。當某個性狀(基因)與某個(些)分子標記協(xié)同分離時,表明這個性狀(基因)與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小,即表示目標基因與分子標記之間的距離,從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上,可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后,所切的片段類型不一樣,因此,限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多,則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。
                      
                      運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA ,隨機擴增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由于其*的檢測DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立于PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區(qū)域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位點分布發(fā)生相應的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時可用的引物數(shù)很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測。另外,RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。
                      
                      本實驗將學習RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。

                      
                      RFLP技術
                      
                      一、 材料
                      基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
                      
                      二、設備
                      電泳儀及電泳槽, 照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊,吸水紙若干,尼龍膜(依膠大小而定),濾紙 ,eppendorf管(0.5ml)若干。
                      
                      三、試劑:
                      1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
                      2、5×TBE電泳緩沖液:配方見*章。
                      3、變性液:0.5mol/L NaOH,1.5mol/L NaCl 。
                      4、中和液:1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
                      5、10×SSC:配方見第九章。
                      6、其它試劑:0.4mol/L NaOH,0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ,ddH2O,Agarose 0.8%, 0.25mol/L HCl 。
                      
                      四. 操作步驟
                      1. 基因組DNA的酶解
                      (1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。
                      (2) 在50μl反應體系中,進行酶切反應:
                        5μg基因組DNA
                        5μl 10×酶切緩沖液
                        20單位(U)限制酶(任意一種)
                        加ddH2 O, 至50μl
                      (3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。
                      (4) 取5μl反應液,0.8%瓊脂糖電泳觀察酶切是否*,這時不應有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
                      [注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應一定要*。
                      
                      2. Southern轉移
                      (1) 酶解的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。   
                      (2) 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。   
                      (3) 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉至中和液中和30分鐘。
                      (4) 預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉移或真空轉移。
                      (5) 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
                      (6) 將膜夾于2層濾紙內, 80℃真空干燥2小時。
                      (7) 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
                      [注意] 1、 步驟(2)中脫嘌呤時間不能過長。
                          2、 除步驟(1)、(4)、(5)外, 其余均在搖床上進行操作。
                          3、步驟(4)中,當尼龍膜覆于膠上時, 防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時也不應有氣泡發(fā)生。
                          4、有時用一種限制性內切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異,這時應該試用另一種酶。


                      RAPD技術
                      
                      一、 材料
                      不同來源的DNA(50ng/ul)。
                      
                      二、設備
                      PCR儀,PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管,電泳裝置。
                      
                      三、試劑
                      1、隨機引物(10mer) (5umol/L):購買成品。
                      2、Taq酶:購買成品。
                      3、10xPCR 緩沖液:配方見第八章。
                      4、MgCl2 :25mmol/L。
                      5、dNTP:每種2.5mmol/L。
                      
                      四、操作步驟:
                      1. 在25ul反應體系中,加入
                        模板DNA 1ul (50ng)
                        隨機引物 1ul (約5pmol)
                        10xPCR Buffer 2.5ul
                        MgCl2 2ul
                        dNTP 2ul
                        Taq酶 1單位(U)
                        加ddH2O 至 25ul
                      混勻稍離心, 加一滴礦物油。
                      2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然后循環(huán): 94℃ 1分鐘, 36℃ 1分鐘, 72℃ 1分鐘,共40輪循環(huán)。
                      3. 循環(huán)結束后, 72℃ 10分鐘,4℃保存。
                      4. 取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊, 分辨率高)。
                      5. 電泳結束,觀察、拍照。
                      [注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
                          2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記應用。

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